中科院西北特色植物资源化学重点实验室/甘肃省天然药物重点实验室知识库

    荧光探针因其灵敏度高、选择性好、可实现原位、实时快速分析、以及对样品无损等优点，在分析化学、环境科学和生命分析等领域的应用得到广泛的关注。近年来，荧光探针用于与生命过程密切相关的阴离子、阳离子、中性分子和生物大分子的识别和分析检测获得了极大发展。其中，信号增强型荧光探针、比率型荧光探针和多功能型荧光探针尤为受到关注。本论文结合荧光探针的作用机理和荧光探针的研究现状，以发展具有优异性能的荧光探针为目标，设计合成了一系列用于生物活性分子检测的荧光探针。采用紫外-可见吸收光谱、荧光发射光谱、核磁共振氢谱和质谱等多种谱学手段研究了探针对活性氧自由基、SO₂衍生物和巯基化合物的识别性能和传感机理。同时，将探针成功应用到活细胞成像分析，并取得了良好的效果。主要研究内容为：

    1.以罗丹明为荧光基团，通过酯化反应与顺磁性的2,2,6,6-四甲基哌啶氧自由基（TEMPO）共价结合，合成罗丹明氮氧自由基荧光探针（R-NO•）并用于谷胱甘肽自由基（GS•）的检测。由于顺磁性的TEMPO与罗丹明存在电子转移作用，探针荧光淬灭，而当探针与GS•作用后，探针能够有效地捕获GS•生成反磁性衍生物，从而导致荧光恢复。同时选用辣根过氧化酶（HRP）催化氧化GSH生成GS•的体系和Fenton反应产生羟基自由基（•OH）氧化GSH生成GS•体系来模拟细胞内GS•自由基产生过程。通过荧光光谱法、高效液相色谱法以及质谱等手段，对反应产物进行分析，并对探针与GS•作用的传感机理进行研究，发现两种体系具有相同的实验结果，证明了•OH能够氧化GSH产生GS•。因此，对于GS•的检测以及产生过程提出了新的方法。同时，我们考察了探针在生物体系的应用，成功将探针应用于HL-60细胞中GS•的检测。

    2.设计合成了以蒽为识别基团的罗丹明荧光探针用于单线态氧的（¹O₂）的检测。由于蒽分子与荧光团激发态存在的电子转移作用，使得探针的荧光被淬灭，基于蒽识别基团与¹O₂特异性作用，生成稳定的内过氧化物而导致探针荧光恢复的机制，实现对¹O₂的特异性识别。通过紫外-可见吸收光谱、荧光光谱及质谱等手段研究了探针与¹O₂的反应机理。荧光滴定实验表明，该探针对¹O₂的检测具有较宽的线性范围和较低的检测限。探针对¹O₂显示出良好的选择性及稳定性。同时，探针被成功应用于细胞内¹O₂的荧光成像。

    3.设计合成了一种用于次氯酸（HClO）和SO₂衍生物（HSO₃^-/SO₃^2-）检测的新型双功能荧光探针。利用次氯酸的强氧化特性以及HSO₃-/SO₃^2-的强亲核性质，探针与次氯酸和亚硫酸氢根离子分别作用后具有不同的激发发射波长，通过不同荧光信号实现两者的双功能检测。探针本身具有弱的橙红色荧光（λ_em=565 nm），与次氯酸和亚硫酸氢根离子反应后，分别产生具有强绿色荧光（λ_em=490 nm）和蓝色荧光（λ_em=400 nm）的两种不同荧光信号产物，因此，可以有效地实现两种重要生物分子的双功能检测。通过高分辨率质谱分析和核磁氢谱分析，研究了探针与次氯酸和亚硫氢酸根离子的反应机理。该探针具有良好的光稳定性，对两种物质的检测具有良好的选择性和较高的灵敏度，并将其成功应用于HeLa细胞中次氯酸的荧光成像。此外，这项工作建立的利用单个荧光探针分子实现双功能检测的设计思路有望拓展应用于其它重要生物分子的检测。

    4.设计合成了一种新型的金纳米簇比率荧光探针（AuNCs-NBD）用于半胱氨酸（Cys）和同型半胱氨酸（Hcy）的检测。其中，牛血清蛋白（BSA）为模板合成的金纳米簇（AuNCs）被用作参比信号单元，硫醚取代的硝基苯并呋咱（NBD-SAr）有机分子被用作响应信号单元及对Cys和Hcy特定识别单元。该探针利用有机分子NBD-SAr对Cys和Hcy的特异性“OFF−ON”响应以及AuNCs对Cys和Hcy的荧光稳定性来实现比率检测。与大多数巯基化合物有机荧光探针相比，金纳米簇比率荧光探针通过双发射波长的测定，提供一个内置的校正而避免环境效应的干扰，从而提高检测的准确性。该探针具有良好的水溶性、比率荧光响应和较低的检测限，且生物相容性高，我们将其成功应用于HeLa细胞中Cys和Hcy的荧光成像。